Pochází z právnické rodiny a vyrůstal na pensylvánském venkově. Po ukončení střední školy přesídlil do Kalifornie, kde navštěvoval California University v San Diegu. Obchodní studia však nedokončil a věnoval se herectví, jež studoval v New Yorku u Stelly Adlerové a na divadelní scéně Circle in the Square.

Ve filmu je obsazován do rolí etnických postav: chamtivý Manny Rodrigo, jehož manželka (Rosie Perezová) přišla při letecké katastrofě o dvouletého synka, v psychologickém dramatu Beze strachu (r. P. Weir); narkoman Benny Dalmau, blízký přítel černošského výtvarníka (Jeffrey Wright), v životopisném dramatu Basquiat (r. J. Schnabel); mafián Gaspare Spoglia v psychologickém gangsterském dramatu Pohřeb (r. A. Ferrara); výborný baseballový hráč Juan Primo, kterého zabije fanoušek (Robert De Niro) jeho černosšského rivala ze stejného mužstva (Wesley Snipes), v kriminálním dramatu ze sportovního prostředí Fanatik (r. T. Scott).

Zatím jeho nejlepší film. rolí, za kterou získal cenu Independent Spirit Award, je zločinec Fenster v kriminálním dramatu Obvyklí podezřelí (r. B. Singer). Postavení kultovního herce zpěčetil postavou samojského právního zástupce dr. Gonza, o jehož "psychedelickém" putování z Los Angeles do Las Vegas se sportovním novinářem (Johnny Depp) vypráví černá komedie podle knihy Huntera S. Thompsona Strach a hnus v Las Vegas (r. T. Gilliam).

Vedlejší úloha tijuanského policisty Javiera Rodrigueze v dramatu o obchodu s drogami Traffic (r. S. Soderbergh) mu vynesla Oscara 2000, Zlatý glóbus 2000, cenu BAFTA 2000 a Stříbrného medvěda na MFF v Berlíně 2001.

Benicio Del Toro si v roce 2005 zahrál ve filmu režiséra Roberta Rodrigueze, Sin City - město hříchu. Objevil se zde v povídce "Velká tučná zabijačka" jako Malej Jackie, kdysi poctivý, ale dnes zkorumpovaný policajt, který ve Starém Městě Sin City vyvolává spoustu problémů. Benicio Del Toro nejen dokonale využil svého všestranného hereckého umění, ale také, podle slov autora Sin City, Franka Millera, ztvárnil Malýho Jackieho přesně tak, jak ho Miller nakreslil. Aby se Del Toro více přiblížil své postavě, konzultoval s Frankem minulost Malýho Jackieho, který býval hrdinou, ale postupem času se z něj stal surovec a bezcitný chlap. Dokonce se i domlouval s odborníky, jak má vypouštět cigaretový kouř z úst, aby vypadal přesně jako Malej Jackie.

Jako host se objevil v TV seriálech O'Hara, Miami Vice - ČTV, Tales from the Crypt (Příběhy ze záhrobí - ČTV).

Je autorem a režisérem krátkého snímku o obchodu s narkotiky Submission (1995, Podrobení).