Narodila se v Bruselu. Své dětství strávila vedle rodné Belgie také v Anglii a Nizozemsku; v Arnhemu prožila druhou světovou válku, včetně operace Market Garden. Její matka, baronka Ella van Heemstra (1900 –1984), pocházela z velmi staré a významné nizozemské rodové šlechty, příjmení Hepburn pak pochází od Irských šlechtických předků jejího otce Josepha Rustona (21. 11. 1889 Úžice – 16. 10. 1980 Dublin)(údajně byl jeho předkem James Hepburn, hrabě Bothwell, třetí manžel skotské královny Marie Stuartovny), jenž se narodil 15 km severně od Prahy v obci Úžice, kde jeho rodina vlastnila cukrovar Jos. J. Ruston.

Původně chtěla být primabalerinou a baletu se také plně věnovala. Později získala stipendium na prestižní baletní škole v Londýně, kam se s matkou po válce přestěhovala. Brzy však zjistila, že kvůli své tělesné výšce a válečnou výživou narušené konstituci, nemůže s kariérou primabaleriny počítat. V baletním souboru si jí ale všimli muzikáloví a filmoví producenti a brzy získala své první malé role v nevýznamných britských filmech. V roce 1951 na popud francouzské spisovatelky Colette přijala nabídku na titulní roli broadwayské show Gigi, poprvé opustila evropský kontinent a odjela do USA.

Prakticky současně s tím (obsazení 1951, natáčení 1952, premiéra 1953) také přišel druhý zásadní zlom její herecké kariéry v podobě hlavní role v komedii Prázdniny v Římě, která ji vynesla do hvězdné společnosti. Za tento film také získala (v americkém filmu debutující) v roce 1954 cenu americké filmové akademie – Oscar. V témže roce 1954 krátce na to také získala prestižní divadelní ocenění Tony za roli Ondiny ve stejnojmenné broadwayské divadelní hře. Od té doby se objevovala v nejklasičtějších dílech kinematografie jako jsou například: Sabrina (1954) Vojna a mír (1956) Usměvavá tvář (1957) Odpolední láska (1957) The Nun’s story (1959) Snídaně u Tiffanyho (1961) Šaráda (1963) My Fair Lady (1964) Čekej do tmy (1967) Robin a Mariana (1976).

Měla velmi charakteristický měkký hlas v mezzosopránové poloze, který také v několika filmech předvedla i při zpěvu - např. ve snímku Usměvavá tvář nebo ve filmu Snídaně u Tiffanyho. Ve světoznámém muzikálu My Fair Lady její zpěv dabovala zpěvačka Marni Nixonová.

Pro mnohé představovala nový typ krásy, její útlý vzhled často řídil vývoj módy a dodnes zůstává nedostižným symbolem elegance, idolem osobního šarmu, noblesy i charisma, jakož i svérázným prototypem nevšední krásy, inteligence a mimořádné oduševnělosti (Audrey hovořila plynně sedmi světovými jazyky).[2] Toto vše se ale v její útlé osobě dosti vzácně snoubilo s velkým hereckým a pohybovým nadáním do nenapodobitelného originálu, který dodnes obdivují miliony filmových a televizních diváků na celém světě. Kromě toho porodila a úspěšně vychovala dva syny.

V osmdesátých letech, v posledních letech svého života, se věnovala především práci pro humanitární organizace. V roce 1987 se stala oficiálním velvyslancem dobré vůle UNICEF. Cestovala do rozvojových zemí, například do Somálska, kde pomáhala hladovějícím dětem. Její synové v tom pokračují, mimo jiné, na její oficiální stránce.

Zemřela na rakovinu slepého střeva 20. ledna 1993 ve švýcarském Tolochenaz v kantonu Vaud, kde je také pochována.

Má hvězdu na Hollywoodském chodníku slávy.